摘要:從健康的蛋雞腸道內分離鑒定了一株耐酸耐膽鹽乳桿菌SL3菌株。該菌可產生一種對大腸桿菌（E.coli）、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、金黃色葡萄球菌（S.aureus)和溶壁微球菌(M.lysodeikticus)均具有抑制作用的類細菌素，且具有良好的腸道黏附能力和生物安全性，可作為微生態制劑的優良菌種使用。

關鍵詞：乳桿菌；分離鑒定；益生菌；類細菌素

    自1928年抗生素發明以來，其用途越來越廣泛，甚至已經達到了濫用的程度，尤其是在畜禽養殖業。盡管有關部門三令五申禁用某些抗生素，并對一些允許添加的抗生素要求嚴格限量。但是養殖業主為了減少畜禽的發病率和死亡率，不斷在飼料中超標添加各種抗生素和激素?？股氐臑E用導致微生態失衡，大量耐藥菌株不斷產生，給人類的健康帶來嚴重的威脅。食品安全尤其是畜禽產品的安全問題是擺在政府監管部門的一個難題，同時也是人們日常消費不得不去面對的問題。

益生菌制劑以其無毒、無殘留、無耐藥性、低成本，并能有效補充畜禽消化道內的有益微生物，調節腸道微生態平衡等優點，被認為是抗生素的理想替代品而使用[1]。乳桿菌(Lactobacillus)是動物機體內正常的生理菌群之一。乳桿菌可粘附于腸道粘膜細胞上,一方面對腸道粘膜有占位性保護作用,另一方面可刺激腸道局部的免疫反應。本研究從健康蛋雞的腸道中分離了一株益生乳桿菌SL3菌株,并對其抑菌特性、腸道黏附能力及生物安全性等益生特性進行了研究。認為乳桿菌SL3菌株可作為微生態制劑的優良菌株使用。

 

1　材料與方法

 

1.1 材料

1.1.1 樣品來源　健康的10周齡羅曼褐蛋雞。

1.1.2 培養基和試驗試劑配制　試驗所使用的MRS培養基按照陳天壽的《微生物培養基的制造與應用》[2]配制；各種生化培養基和試驗試劑均按照趙斌的《微生物學實驗》[3]配制。

1.1.3 指示菌：大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimur ium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)由華中農業大學微生物實驗室提供；

1.1.4 試驗所用試劑均為市售的分析純。

1.1.5 試驗所用主要儀器設備：離心機（Eppendorf 5415D）、高壓細胞破碎機（JNBIO）、生物安全柜（BIOBASE BSC-1100IIB2-X）等。

1.2 方法

1.2.1 乳桿菌的分離　將健康的10周齡羅曼褐蛋雞頸部放血處死，無菌操作刮取小腸黏膜1g，經稀釋后涂布在MRS瓊脂平板上,37℃培養48h后挑取大小、顏色、形狀、邊緣及在培養基表面位置各異的單菌落，并通過在MRS瓊脂培養基上劃線得到純培養。經革蘭氏染色鏡檢，挑選染色結果為G+的不產芽孢的桿狀菌株,再次劃線純化并保存菌種。

1.2.2 形態學及生理生化鑒定  將挑選出來的菌種依次從形態、生理生化特性、代謝產酸等方面進行鑒定，具體方法參照《伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版)》[4]。

1.2.3 耐酸性試驗　將培養24h的菌液接種于pH值分別為2.0、3.0、4.0、6.8（CK）的MRS液體培養基中，37℃分別處理1h、2h、3h，通過處理前后活菌計數結果計算出細菌存活率。

1.2.4 膽鹽耐受性試驗　將培養24h的菌液接種于膽鹽濃度分別為0（CK）、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%的MRS液體培養基中，37℃處理3h后，平板菌落計數，篩選出對酸和膽鹽耐受能力均較強的菌株進行后續相關試驗。

1.2.5 抑菌試驗  將指示菌大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)培養物分別均勻涂抹在NB平板上, 用直徑6mm無菌打孔器打孔并封底。將乳桿菌的24h發酵培養液在5000rpm離心5min,取上清液備用；將乳桿菌的24h液體培養液進行細胞破碎，取細胞破碎液備用；分別以發酵上清液、細胞破碎液、發酵培養液為實驗樣本，以MRS液體培養基為對照, 37℃培養16h,觀察有無抑菌圈并測量其直徑，每個樣本重復3次,計算平均值。

1.2.6 抑菌物質的確定

1.2.6.1 酸性抑制作用實驗  將乳桿菌SL3菌株培養24h的發酵上清液、乳酸和鹽酸分別調節pH至4.5后, 以大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)為指示菌,進行抑菌試驗。

1.2.6.2 過氧化氫抑制作用實驗  取經過氧化氫酶處理后的SL3菌株發酵上清液,以大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)為指示菌,進行抑菌試驗。

1.2.6.3 蛋白酶處理實驗  在3份乳桿菌SL3菌株培養24h的發酵上清液中分別按照1mg/ml的量加入蛋白酶K、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，37℃處理1h，然后用各處理后的發酵上清液進行抑菌試驗。

1.2.7腸道黏附能力試驗　菌種在含20μl/mL的3H胸腺嘧啶核苷NB培養基中,37℃厭氧培養48h。以實驗室保存的 Bacillus subtilis stain B9 為對照菌株, 37℃培養24h,其余操作均與試驗菌株一致。將培養的細菌于4000rpm離心10min,用含0.1%(W/V)疊氮鈉的HH(Hepes-Hanks, Buffer: 10mmol/LHEPES,pH7.4)液洗滌后,懸浮在HH液中。將細菌的光密度調節至(1-2)×108CFU/mL。

刮取健康的10周齡羅曼褐蛋雞腸道黏液，并參照Rinkinen等[5]的方法進行腸黏液糖蛋白的提取，于-20℃冰箱中保存備用。將含腸黏液糖蛋白的懸浮液于4℃解凍,用HH液稀釋至0.5mg/mL。取100μl稀釋樣品于96孔培養板中,4℃下20 h。輕輕吸棄上液,用HH液洗滌培養板2次,除去未粘在培養板上的糖蛋白,取100μl已標記的細菌,加入到上述培養板中，37℃下1 h。輕輕吸棄上液,用HH液洗滌培養板2次,以除去未黏附的細菌。自然干燥后加入150μl閃爍液,在液閃儀上測定放射性強度CPMa,每個做3個重復,以牛血清白蛋白作為空白對照。另取標記過的細菌HH懸浮液100μl,經0.2μm微孔濾膜過濾,檢測該膜的CPM值,記為CPM0。細菌的黏附率(%)=CPMa/CPM0×100%。

1.2.8 安全性試驗  取1日齡的健康雛雞60只，隨機分為2組，每組30只，試驗組雛雞平均每日飲活菌1×1010個，持續飲活菌21日，觀察雛雞的精神狀態及采食、排便等情況。

 

2 結果

 

2.1 乳桿菌分離和菌落形態觀察

    經厭氧培養48h后，從MRS平板上分離菌株78株，經過革蘭氏染色后鏡檢，從中篩選出G+、無芽孢桿菌10株，分別編號為SL1-SL10。這10株菌的菌落特征為乳白色、圓形、表面光滑凸起、邊緣整齊、直徑0.5-2.0mm，菌體桿狀,多排列成長短不一的鏈狀,也有單個分散排列。

2.2 乳桿菌的生理生化鑒定結果

乳桿菌生理生化鑒定結果見表1。根據《伯杰細菌鑒定手冊(第八版)》，初步判定所選的10株菌均為乳桿菌（Lactobacillus）。

表1 乳桿菌屬菌株的鑒定

Table 1 Identification of the Lactobacillusstrains

菌株	運動性	接觸酶	硝酸鹽還原	明膠液化	產生吲哚	硫化氫	V-P試驗	代謝產酸
SL1	－	－	－	－	－	－	－	a.L
SL2	－	－	－	－	－	－	－	a.L
SL3	－	－	－	－	－	－	－	a.L
SL4	－	－	－	－	－	－	－	a.L
SL5	－	－	－	－	－	－	－	a.L
SL6	－	－	－	－	－	－	－	a.L
SL7	－	－	－	－	－	－	－	a.L
SL8	－	－	－	－	－	－	－	a.L
SL9	－	－	－	－	－	－	－	a.L
SL10	－	－	－	－	－	－	－	a.L

2.3 乳桿菌的耐酸、耐膽鹽篩選試驗結果

乳桿菌的耐酸篩選試驗結果見表2。根據表中的統計結果，挑選在pH2.0、耐受2h和耐受3h條件下，耐酸性較強的SL1、SL3、SL4、SL6、SL9進行了耐膽鹽試驗。

乳桿菌的耐膽鹽篩選試驗結果見表3。由表中可見，膽鹽對乳桿菌的生長有明顯抑制作用。隨著膽鹽濃度升高，5種乳桿菌菌株的存活率均呈現明顯下降趨勢,

綜合待測菌株對酸和膽鹽的耐受情況，可知SL3菌株對酸和膽鹽的耐受效果最佳，故選擇SL3菌株進行后續的試驗。

表2 不同pH值對乳桿菌存活率的影響

Table 2 Effect of different pH values on the survival percentage of the Lactobacillus strains

存活率（%）		SL1	SL2	SL3	SL4		SL5	SL6	SL7	SL8	SL9	SL10
	1h	71.9	52.7	81.1		78.1	55.6	83.1	51.1	62.5	83.7	57.2
pH2.0	2h	70.1	45.8	83.3		76.7	48.4	81.3	44.2	56.6	82.9	55.5
	3h	69.4	40.9	76.8		75.9	44.9	76.2	36.6	54.7	79.1	49.9
	1h	77.8	58.3	86.8		83.1	56.7	83.8	62.2	72.4	86.3	58.1
pH3.0	2h	77.2	49.4	83.9		81.4	48.2	76.1	57.3	69.7	84.0	55.8
	3h	76.4	44.6	80.0		80.9	39.8	75.9	56.9	64.6	82.4	53.1
	1h	79.5	69.6	89.7		91.5	68.4	88.4	76.7	86.4	89.1	69.9
pH4.0	2h	84.2	54.5	90.3		88.7	57.5	86.0	74.3	82.9	87.3	66.4
	3h	85.6	47.2	87.6		78.3	46.3	85.8	70.2	77.8	85.6	60.7

表3 不同膽鹽濃度對乳桿菌存活數的影響

Table 3 Survival of the Lactobacillus strains in different concentrations of bile salt

菌株	0%	0.05%	0.10%	0.20%	0.30%	0.40%
SL1	3.21×106	1.59×105	3.26×104	3.12×103	0.73×102	0
SL3	3.08×106	1.48×106	4.39×105	7.76×104	6.25×103	3.54×102
SL4	2.67×106	8.83×105	4.44×104	3.11×103	0.93×102	0
SL6	8.56×105	1.11×105	6.73×103	7.32×102	1.27×102	0
SL9	3.17×106	7.63×105	7.66×104	2.74×104	2.35×103	0.53×102

 

2.4 乳桿菌抑菌試驗

乳桿菌SL3菌株發酵培養液、發酵上清液、細胞破碎液分別對大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)抑菌試驗結果見表4。由表4得知,乳桿菌SL3菌株發酵培養液、發酵上清液、細胞破碎液均能對（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)具有良好的抑菌效果。且針對具體的某一種指示菌，乳桿菌SL3菌株發酵培養液、發酵上清液、細胞破碎液抑菌效果差異不顯著。說明乳桿菌SL3菌株產生的抑菌物質應該是其釋放到液體培養基中的代謝合成產物。故后續以乳桿菌SL3菌株發酵上清液作為抑菌樣本，來研究其抑菌物質屬性。

表4 Lactobacillus strain SL3對4種指示菌的抑制效果

Table 4  Inhibitory of the Lactobacillus strain SL3 on four indicators

實驗樣本	抑菌環直徑/mm
	大腸桿菌（E.coli）	金黃色葡萄球菌（S.aureus)	鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)	溶壁微球菌(M.lysodeikticus)
發酵培養液	18.6	17.4	18.5	19.0
發酵上清液	18.4	17.1	18.1	18.5
細胞破碎液	18.2	17.0	18.2	18.7
MRS液體培養基	-	-	-	-

2.5 抑菌物質的確定

2.5.1 酸性抑制作用試驗結果見表5。結果表明pH為4.5的乳酸和鹽酸不能抑制指示菌的生長,而pH為4.5的菌株發酵上清液仍具有強烈的抑菌作用,說明排除酸性干擾后的發酵上清液中仍有抑菌活性物質存在。

表5 排除酸作用的抑菌試驗結果

Table 5 Results of antibacterial by supernatant without acid

實驗樣本	抑菌環直徑/mm
	大腸桿菌（E.coli）	金黃色葡萄球菌（S.aureus)	鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)	溶壁微球菌(M.lysodeikticus)
未處理的 發酵上清液	18.4a	17.1a	18.1a	18.5a
pH為4.5發酵上清液	14.2b	11.8b	14.1b	14.6b
pH為4.5鹽酸	-	-	-	-
pH為4.5乳酸	-	-	-	-

注：①“-”表示不抑制；②同列肩標小寫字母相同或無字母表示差異不顯著（P>0.05），小寫字母不同表示差異顯著（P<0.05）。

2.5.2 過氧化氫抑制作用實驗結果見表6。結果表明乳桿菌SL3菌株發酵上清液在排除了過氧化氫干擾后仍然具有較強的抑菌作用，說明在SL3菌株發酵上清液中主要抑菌作用的不是過氧化氫。

表6 過氧化氫酶處理后的抑菌試驗結果

Table 6 Results of antibacterial after treatment with hydrogen peroxidase

實驗樣本	抑菌環直徑/mm
	大腸桿菌（E.coli）	金黃色葡萄球菌（S.aureus)	鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)	溶壁微球菌(M.lysodeikticus)
未處理的 發酵上清液	18.2	17.3	17.8	19.1
過氧化氫酶處理的發酵上清液	17.4	16.6	16.9	18.3

注：同列肩標小寫字母相同或無字母表示差異不顯著（P>0.05），小寫字母不同表示差異顯著（P<0.05）。

2.5.3 蛋白酶處理試驗結果見表7。結果表明在使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理后的發酵上清液完全喪失抑菌活性, 說明SL3菌株的發酵上清液中的抑菌物質是一種蛋白質或多肽。

根據以上酸性抑制作用、過氧化氫抑制作用實驗和蛋白酶處理試驗結果,說明SL3菌株發酵產生的抑菌物質是一種類細菌素。

表8 乳桿菌SL3菌株和枯草芽孢桿菌B9株在腸黏液蛋白上的黏附率

Table 8  Glycoprotein adhesion ratios of Lactobacillus strain SL3 and Bacillus subtilis strain B9

菌株	細菌在腸黏液蛋白上的黏附率/%
SL3	20.12±1.28
B9	7.22±0.95